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不同分散介质研磨所得纳米珍珠粉的比较
作者：admin日期：2020-04-23阅读
珍珠(层)粉主要由碳酸钙(无机物)和质组成，富含18种氨基酸、多种微量元素和维生素及大量的活性钙，具有、美容护肤、作用，能够促进伤口，对、、溃疡有很好的治疗效果，其在医学上具有广泛的价值[1-8]。而纳米级珍珠粉中碳酸钙具有的性，有利于机体对有效成分吸收，疗效更佳[9-11]。
珍珠(层)具有与骨相类似的结构特点，具有良好的生物学及物理学特性，其在骨组织中的应用研究引起越来越多的关注。众多研究表明，珍珠(层)粉具有良好的生物相容性、生物降解性、骨传导和骨诱导作用[12-15]，可以作为骨组织工程支架材料，而纳米级珍珠(层)粉具有的生物降解性和成骨作用[16-22]。
为了保留更多的质及材料生物学活性，常常需要通过物理方法研磨细化珍珠粉。球磨法是通过研磨介质之间的碰撞、挤压、剪切和摩擦等原理来磨碎物料，可以大限度地保留珍珠粉中的质及其活性，故在中得到广泛应用，而不同分散介质对球磨制备纳米材料效果不同。实验应用砂磨机对微米级淡水珍珠粉进行研磨细化，通过透射电镜、扫描电镜和X射线衍射观察分析珍珠粉的形态特点，运用食品中氨基酸的测定和凯氏定氮法检测方法分析其蛋白质和氨基酸含量变化。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 对比观察性实验。
1.2 时间及地点 实验于2013年6月至2014年4月完成，在深圳市科力纳米工程设备有限公司完成材料研磨，珍珠粉氨基酸、蛋白质检测结果在广州分析测试中心完，其余检测在海南大学分析测试中心完成。
1.3 材料 微米级珍珠粉、淡水珍珠；六偏磷酸钠；0.1 mm氧化锆球，进口。
实验用主要仪器：X射线衍射仪(Bruker D8 advance，德国)；小型离子溅射仪(JS-1600，北京和同创业科技有限责任公司)；高分辨透射电子显微镜(JEM-2100，日本)；扫描电子显微镜(Hitachi S-4800，日本)；立式双轴纳米陶瓷砂磨分散机(KLLN-1，深圳市科力纳米工程设备有限公司)；氨基酸全自动分析仪(塞卡姆 Sykam s-433D，德国)；超声波分散机(Branson B2500S-MTH，美国)。
1.4 实法
1.4.1 纳米淡水珍珠粉的制备[23-24] 启动KLLN-1砂磨分散机，分散剂清洁研磨系统，将微米珍珠粉与无水乙醇(或蒸馏水)以1 g/15 mL的比例在砂磨机中研磨2 h，干燥备用。其中研磨筒体内含1.85 kg直径0.1 mm氧化锆球，工艺参数：主机转速1 800 r/min，进料压力0.35 kPa。研磨原理：粉体与液体介质经过分散器分散，通过研磨球对液相中的粒子的撞击或对粒子表面摩擦处理来细化材料颗粒，材料在研磨体系中不断而达到高效研磨。
1.4.2 扫描电镜观察 取珍珠粉样品黏附于金属样品台导电胶带上，喷铂，镜下观察采集图像。
1.4.3 透射电镜观察样品 将珍珠粉样品悬浮液滴入碳膜铜网上，干燥，置样品槽中，观测粉体形态并采集图片。通过Nano Measurer 1.2软件，以近似等效圆形的直径测量珍珠粉粒径，并对珍珠粉颗粒粒径进行统计学分析(SPSS Statistics 17.0)。
1.4.4 X射线衍射分析样品 取适量珍珠粉样品，压成薄片，固定于观测台上检测。将测量数据导入X’ pert Highscore软件中，分析研究样品的无机物相类型及含量，通过谢乐公式估算其相对平均晶粒粒径，利用RIR参考强度比的方法估算各物相相对百分比。
1.4.5 蛋白质、氨基酸检测 参照食品中氨基酸的测定和凯氏定氮法检测珍珠粉中蛋白质和水解氨基酸的含量，作2个平行实验，取平均值。
1.5 主要观察指标 两种分散介质研磨所得珍珠粉的形态特点及蛋白质和水解氨基酸含量差异。
1.6 统计学分析 对于珍珠粉的粒度， 采用SPSSStatistics 17.0软件进行统计学分析，选择两个独立样本的非参数wilcoxon秩和检验进行比较分析。
2 结果 Results
2.1 珍珠粉扫描电镜观察结果 珍珠粉扫描电镜观见图1，微米级珍珠粉中含有大量文石板片，形状不规则，大小不均，主要集中在2-5 μm；以无水乙醇为分散介质研磨的珍珠粉主要为类圆形颗粒，大小不等，主要分布在30-50 nm；而以蒸馏水为分散介质研磨的珍珠粉主要为类圆形颗粒，存在较大
的条状或块状不规则颗粒，大小不均。
图注：A(×3 500)，B(×20 000)为微米级珍珠粉，含有大量文石板片，形状不规则，大小不均，主要集中在2-5 μm；C 为以无水乙醇为分散介质研磨后的珍珠粉，主要为类圆形颗粒，大小不等，主要分布在30-50 nm；D 为以蒸馏水为分散介质研磨的珍珠粉，主要为类圆形颗粒，存在较大的条状或块状不规则颗粒，大小不均图1 微米级珍珠粉经不同分散介质研磨前后的扫描电镜观察
Figure 1 Scanning electron microscope observation of micron pearl
powder before and after grinding with different dispersion media
2.2 珍珠粉透射电镜观察结果 以无水乙醇为分散介质研磨获得的珍珠粉颗粒主要为类圆形，大小不等，基本都在100 nm以下(图2A)。对颗粒粒径进行单样本K-S检验，P <0.05，即非正态分布，算术平均粒径为37.45 nm，差为70.18 nm，中位数为34.72 nm，标准差为11.73 nm，即珍珠粉粒径分布较集中，分布相对均匀(表1)。
以蒸馏水为分散介质研磨获得的珍珠粉形态多样，主要为类圆形颗粒及大量条状或块状不规则颗粒(图2B)。对颗粒粒径进行单样本K-S检验，P < 0.05，即非正态分布，算术平均粒径为53.66 nm，小值为13.77 nm，大值为438.25 nm，差为424.48 nm，中位数为41.06 nm，标准差为44.68 nm，即珍珠粉粒径差异较大，粒度分布较离散(表1)。
两种不同分散介质研磨后的珍珠粉粒度平均数都小于100 nm，即研磨后珍珠粉属于纳米级，通过SPSS软件进行统计学分析，选择两个独立样本的非参数wilcoxon秩和检验进行比较分析，即两种分散介质研磨后的珍珠粉粒度有明显差异(P < 0.001)，见图3，以无水乙醇为分散介质研磨后珍珠粉粒度更细、更均匀。
2.3 珍珠粉X射线衍射数据分析 X射线衍射分析图谱见图4，衍射角10°-25°范围内出现了玻璃相，而研磨前微米级珍珠粉出现的玻璃相图像更明显，可能是物及微量元素等。参照碳酸钙标准卡片(文石、球文石、方解石)衍射峰特点，珍珠粉无机物主要由文石型和方解石型碳酸钙两种无机晶体组成，无球文石碳酸钙衍射峰。各组珍珠粉碳酸钙的衍射峰形态大致相一致，研磨后的珍珠粉峰位置轻微向右移动，衍射峰强度明显下降，宽度加大，是研磨细化后珍珠粉颗粒纳米化表现，而方解石衍射峰有所增宽，其中以蒸馏水为分散介质研磨的珍珠粉表现更明显，即由文石型碳酸钙转化方解石碳酸钙更明显。通过谢乐公式及RIR参考强度比计算结果示：微米级珍珠粉、以无水乙醇与蒸馏水为分散介质研磨后珍珠粉中的碳酸钙相对平均晶粒大小分别为50，20，30 nm；微米级珍珠粉中文石型和方解石型碳酸钙相对百分比分别为97%和3%，以无水乙醇为分散介质研磨后珍珠粉中的方解石碳酸钙相对百分比增加至7%；以蒸馏水为分散介质研磨后珍珠粉中的方解石碳酸钙相对百分比增加至10%，见图
5，即在以无水乙醇为分散介质研磨珍珠粉颗粒更细，方解石碳酸钙含量更少，相对更稳定。
2.4 珍珠粉蛋白质、氨基酸检测结果 各组珍珠粉中氨基酸和蛋白质含量检测结果示见表2，珍珠粉中含有16种氨基酸，其中含量较多的是天冬氨酸甘氨酸、丙氨酸等，微米级珍珠粉中蛋白质含量约为2.18%，氨基酸约为2.0%；以无水乙醇为分散介质研磨后珍珠粉中蛋白质、氨基酸含量基本没变，个别氨基酸含量有；以蒸馏水为分散介质研磨后珍珠粉中蛋白质、氨基酸含量都有减少。
3 讨论 Discussion
珍珠由一系列同心圆状珍珠质层组成，有明显的圈层结构，文石板片层层堆砌，形成规整紧密相邻的“类砖墙结构”，珍珠核心部位晶体板片排列紊乱，呈碎片状，其表面珍珠层主要为文石型碳酸钙，而核心部位为方解石晶型碳酸钙[25-26]。碳酸钙是自然界中一种比较丰富的矿物质，贝壳、珍
珠、珊瑚等部分甚至全部由文石碳酸钙组成，有3种晶体结构：文石、球文石和方解石，其中方解石是稳定的，而文石在常温常压下是亚稳定晶型，自然状态下不会向方解石转化，除非暴露于溶剂中或高温状态下，它受饱和度、温度、酸碱度、压力等多因素影响[27-28]。珍珠粉主要由文
石碳酸钙组成，而乙醇常常作为碳酸钙的分散溶剂[29]，也可作为研磨珍珠粉的分散介质。
珍珠粉在以蒸馏水为分散介质研磨细化过程中，可见浆液表面产生了泡沫层，需要额外添加消泡剂，对珍珠粉的质量有一定影响，给后续处理带来了不必要的麻烦。扫描电镜、透射电镜下可见，以蒸馏水为分散介质研磨的珍珠粉颗粒形态大小差异较大，粒度分布不均，存在大量条形及块状颗粒，
这可能是珍珠粉颗粒在水中容易团聚，研磨过程中浆料表面产生泡沫层而使部分材料欠研磨，珍珠粉平均粒径为53.66 nm，差为424.48 nm，即珍珠粉粒径差异较大，粒度分布较离散，但达到纳米级标准。X射线衍射仪检测结果表明，以蒸馏水为分散介质研磨的珍珠粉方解石衍射峰，强度高于以无水乙醇为分散介质研磨的珍珠粉，相对百分比含量明显增加，即珍珠粉研磨过程中部分文石碳酸钙向方解石转变。此外，以蒸馏水为分散介质研磨珍珠粉中的氨基酸和蛋白质含量明显减少了，这可能是在研磨珍珠粉过程中浆液容易产生泡沫，增加了珍珠粉与空气接触机会，其中
成分容易发生氧化反应而减少，也可能是消泡剂对珍珠粉中物有影响，这需要在后续实验中进一步研究。珍珠粉在以无水乙醇为分散介质研磨细化过程中，浆料液面无泡沫层产生。透射电镜下可见，以无水乙醇为分散介质研磨的珍珠粉主要是由类圆形颗粒组成，大小不均，以30-50 nm颗粒居多，平均粒径为37.45 nm，按照和欧盟对纳米材料的定义，其符合纳米材料标准，即研磨后珍珠粉为纳米级珍珠粉。而对两种不同分散介质研磨后珍珠粉粒度进行统计学分析(非参数wilcoxon秩和检验)，即两种分散介质研磨后的珍珠粉粒度有明显差异(P < 0.001)，而以无水乙醇为分散介质研磨的珍珠粉粒度更细、更均匀。X射线衍射仪检测结果表明，以无水乙醇为分散介质研磨的珍珠粉峰位置轻微向右移动，较以蒸馏水为分散介质研磨珍珠粉右移明显，衍射峰强度明显下降，宽度加大，研磨后珍珠粉中碳酸钙平均晶粒大小由50 nm减少至20 nm，而方解石相对百分比含量为7%，明显于以无水乙醇为分散介质研磨的珍珠粉，即研磨细化后珍珠粉颗粒纳米化更佳。此外，以无水乙醇为分散介质研磨珍珠粉中的蛋白质和氨基酸含量无明显变化，个别氨基酸含量升高，可能是研磨后珍珠粉中的水份部分丢失引起，这与张建刚等[30]学者通过球磨制备纳米珍珠层粉的研究结果相类似，因此，珍珠粉在乙醇分散介质中研磨具有的稳定性，研磨效果更佳。但是，实验没有就乙醇对珍珠粉中质的影响进行研究比较，有待后续进一步研究。
文石硬度和密度比方解石高，可以降解而被骨替代，具有良好生物相容性，可以作为骨材料和组织工程支架，也可以作为药物传输系统，具有较好生物医学材料的属性[28，31]，而以无水乙醇为分散研磨介质可以保留更多的文石碳酸钙和质。
