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介质研磨法制备尼莫地平纳米混悬剂
作者：admin日期：2020-07-14阅读
尼莫地平(nimodipine，1)是二代钙离子拮抗剂，可选择性作用于脑血管平滑肌、扩张脑血管、增加脑血流量，用于急性脑出血后脑血管引起的缺血性神经[1]。1可溶于乙醇、乙醚等溶媒，不溶于水，且存在严重的肝过效应，口服生物利用度为3％～28％[2]。
纳米混悬剂是以表面活性剂或聚合物为稳定剂，将纳米的药物粒子分散在水中形成的稳定胶体分散体系[3]。因其粒径小，可显著提高药物的饱和溶解度，增加药物的溶出速率，提高生物利用度。制备纳米混悬剂的常用方法有沉淀法、高压均质法及介质研磨法[4,5]。介质研磨法生产效率高、可控性强、重现性好，使用广泛。本研究采用该法制备1纳米混悬剂，以粒径和电位为指标优选和工艺，进一步制成冻干纳米粉，并进行理化性质的表征。
1仪器与试药
DYNO-MillResearchLab介质研磨机[华尔宝机械(深圳)有限公司]；NanoZS-90型激光粒度仪(英国Malvern公司)；1525型高效液相色谱仪(美国Waters公司，包括Empower系统和2487型检测器)；Lyo-0.5L型冷冻干燥机(东富龙公司)；204F1型差示扫描量热仪(德国Netzsch公司)；D8Advance型粉末X射线衍射仪(德国Bruker公司)；H-600型透射电镜(日本Hitachi公司)。1原药(郑州瑞康制药有限公司，含量>99.9％，批号20110703，粒径<10μm)；1对照品(食品药品检定研究院，供含量测定用，批号100270-200002)；十二烷基磺酸钠(SDS，医药集团化学试剂有限公司)；泊洛沙姆188(F68，巴斯夫有限公司)；羟丙甲纤维素(HPMCE5，美国陶氏化学公司)。
2方法与结果
2.1纳米混悬剂的制备
将适量稳定剂加至蒸馏水100ml中，超声至完全溶解。100r/min搅拌下缓慢加入经气流粉碎的1(平均粒径5μm)，继续搅拌10min，得初混悬液；然后倒入介质研磨机进料斗，照设定转速和时间进行研磨。
2.2粒径及电位的测定
取1纳米混悬剂稀释至20μg/ml，置激光粒度仪的样品池中，25℃下测定纳米混悬剂的粒径、多分散系数(PDI)及电位。
2.3单因素试验优化
2.3.1稳定剂浓度对粒径及稳定性的影响
分别取F68与HPMC(1∶1)的混合物0.1、0.2、0.4g(即浓度为0.1％、0.2％和0.4％)，SDS0.05g，溶于水100ml中，作为稳定剂，各加入10.2g(即药物浓度为0.2％)。采用0.1mm粒径的氧化锆珠，在4000r/min转速下研磨15min，制备1纳米混悬剂。将制得的纳米混悬剂室温避光放置10d，考察样品稳定性。结果见图1。
在考察的浓度范围内，稳定剂浓度对粒径的影响并不显著；但可影响PDI和电位。稳定剂浓度为0.1％和0.2％的样品放置10d会出现少量沉淀，其他样品则均一稳定。当稳定剂浓度为0.4％时，粒径及PDI都能达到要求，制备的混悬体系在10d内也较稳定，故选用。
2.3.2F68/HPMC比例的影响
取F68/HPMC质量比分别为1∶5、1∶3、1∶1、3∶1和5∶1的混合物，其他条件同上“2.3.1”项，制备1纳米混悬剂。考察各样品室温放置10d的稳定性。结果见图2。F68/HPMC比例为5∶1时样品的粒径和PDI较大，放置5d出现少量沉淀，放置10d出现大量沉淀；当F68比例较时，制备的1纳米混悬剂粒径和PDI较小，但F68/HPMC比例为1∶5的样品放置后会出现少量沉淀，故F68/HPMC的优化比例为1∶3。
2.3.3药物浓度的影响
在上述优化得到的稳定剂溶液100ml中分别加入10.2、0.4和0.8g。其他条件同“2.3.1”项，制备1纳米混悬剂。室温放置10d，考察样品稳定性。结果见图3。
药物浓度为0.2％和0.4％时对1纳米混悬剂的粒径没有显著影响，但浓度增加到0.8％时，粒径和PDI都显著。1浓度为0.4％的样品放置10d出现少量沉淀，浓度为0.8％的样品放置10d则出现大量沉淀。故优选的药物浓度为0.2％。
2.4单因素试验优化工艺
照“2.3”项下的优化结果制备1纳米混悬剂，倒入介质研磨机进料斗，加入不同粒径的氧化锆珠，在不同转速下研磨不同时间，考察工艺参数对制品粒径及PDI的影响。
2.4.1氧化锆珠粒径
分别采用0.3和0.1mm的氧化锆珠，转速4000r/min研磨15min。结果所得纳米混悬剂粒径为(1103.4±30.6)和(295.6±13.4)nm(n=3)。因此
选用0.1mm的氧化锆珠。
2.4.2转速
采用0.1mm氧化锆珠，分别在2500、3500、4000和4500r/min条件下研磨15min。所得纳米混悬剂的粒径和PDI结果见图4。随转速，制品粒径和PDI逐渐变小，但增加到4500r/min时粒径反而，原因可能是转速过高时粒子的机械运动加强、产热加速，使粒子聚集加速。另外，转速
越快也会使氧化锆珠之间的碰撞加剧，导致温度上升，可能对药物的稳定性产生不利影响，且影响仪器寿命。因此，转速选择4000r/min。
2.4.3研磨时间
采用0.1mm氧化锆珠，在4000r/min条件下分别研磨5、10、15、30和45min，测定纳米混悬剂的粒径和PDI。结果见图5。随研磨时间的延长，粒径和PDI呈现先减少后增加的趋势。研磨时间过长，不但增加能耗，还会影响氧化锆珠的寿命。因此研磨时间定为15min。
2.5工艺重现性研究
照“2.3”和“2.4”项下的优化结果制备3批
1纳米混悬剂，结果3批制品的粒径、PDI和电位分别为(261.2±5.7)nm、0.160±0.022和(-31.6±2.6)mV。表明采用此方法制备的1纳米混悬剂重现性良好。
2.6表征
2.6.11纳米混悬剂的形貌
取照优化和工艺制备的1纳米混悬剂1滴置铜网上，采用0.1％磷钨酸溶液负染，空气中晾干后用透射电镜观察1纳米粒子的外观形貌。结果(图6)可见，1纳米粒子为近球状晶体，分散性良好、粒子较圆润、均一性好，粒径约250nm，这与采用激光粒度仪测定的结果(见图7A)基本相符。电
位为(-32.1±0.4)mV(n=3)(见图7B)，推测该体系稳定性较好。
2.6.21纳米冻干粉晶型的考察
为表征纳米冻干粉中1的晶型存在状态，进行X射线衍射(XRD)及差示扫描量热(DSC)检测。
1冻干纳米粉的制备：取照优化和工艺制
备的1纳米混悬剂2ml置10ml西林瓶中，置冷冻干燥机搁板上，于搁板温度20℃、冷阱温度-50℃、真空度0.1mbar的条件下冷冻干燥40h。XRD分析：采用Cu靶Kα射线；电压40kV，电流40mA，扫描角度3～45°，扫描速率8.0°/min。
对1原药、各辅料及1冻干纳米粉进行测定。结果见图8。
XRD分析表明，药物和辅料的物理混合物中有原药的特征衍射峰，表明辅料的存在不会影响药物的结晶型态；在冻干纳米粉的XRD图谱中也可见与1原药相同、但强度有所减小的特征衍射峰，表明经研磨和干燥过程后药物仍以晶型状态存在。
DSC分析条件：坩埚类型铝坩埚(针刺穿孔)；升温速度10℃/min；吹扫气高纯氮，20ml/min；保护气高纯氮，60ml/min。对1原药、各辅料及1冻干纳米粉进行测定，以进一步确定1在冻干纳米粉中的物理形态。结果见图9。可见，1原药在约125℃处有一个明显的特征峰；物理混合物中也能明显看到该特征峰。对于冻干纳米粉，药物的特征吸热峰依然存在。结合XRD的结果可判断，利用介质研磨法和冷冻干燥制备的1纳米冻干
粉物仍以晶型状态存在。
2.71纳米冻干粉饱和溶解度的测定
2.7.1色谱方法
色谱条件：色谱柱DiamonsilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相甲醇∶乙腈∶水(35∶38∶27)；检测波长237nm；流速1.0ml/min；柱温40℃；进样量20μl。线性范围及方法学研究：1浓度c在5～
51μg/ml范围与峰面积A呈良好线性关系(标准曲线方程为A=72494c+6062，R2=0.9999)。日内RSD分别为0.24％、0.20％和0.17％(n=3)；日间RSD分别为0.20％、0.34％和0.16％(n=3)。回收率为(98.88±0.10)％、(99.84±0.73)％和(99.33±0.38)％(n=3)。
2.7.2饱和溶解度的测定
将过量1原药和1纳米冻干粉分别加至蒸馏水中，室温(25℃)下以100r/min的频率连续振摇72h。为避免稳定剂对1增溶作用的影响，另设配以与纳米冻干粉相同种类及比例稳定剂的原药组，同法处理。平衡72h后，取各饱和溶液5ml，离心(10625×g)10min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，续滤液再采用0.05μm滤膜过滤，吸取续滤液进样测定，记录峰面积，计算饱和溶解度。结果见表1。
1原药在水中的溶解度非常，辅料对1溶解度有一定作用，但不明显。制成冻干纳米粉后1的饱和溶解度较原药提高了近60倍，该结果验证了的关系，当粒径降至纳米级别时，其饱和溶解度会随其粒径减小而显著。
3讨论
介质研磨法操作简单、效率高、工艺重现性好，工业生产中利用广泛。目前，利用纳米结晶技术上市的10个产品中有9个采用介质研磨法制备[6,7]。根据Ostwald-Freundlich方程，粒径减小至微米甚至纳米级时，药物的饱和溶解度会显著；
同时，由于粒径小、比表面积大、表面自由能大，粒子易相互碰撞而聚集。因此，筛选合适的稳定剂至关重要。本研究联合使用了立体稳定剂(F68和HPMC)和静电稳定剂(SDS)，制备了粒径较小且稳定的纳米混悬剂。工艺重现性研究结果表明，所得纳米混悬剂批间差异较小、重现性良好。优化后纳米冻干粉溶解度较原药提高了近60倍。Kelvin和Ostwald-Freundlich方程中粒径与溶解度
